کریسپر

مقدمه

CRISPR که مخفف Clustered Regulary Interspacer Short Palindromic Repeat است، همانند اسمش تاریخچه طولانی دارد.   از کشف توالی تکراری خاص در ژاپن تا ویرایش و مهندسی ژنوم در اروپا و امریکا همگی گواه بر این است که کشف CRISPR همانند کشف تکنیک PCR سبب انقلابی در زمینه علم بیولوژی شده است.  همانگونه که کشف یک DNA پلیمراز مقاوم به حرارت سبب افزایش کارایی و عمومیت PCR  شد، کشف cas9 نیز سبب درک و  باور به تکنیک CRISPR شد تکنیکی که دریچه های جدیدی مقابل ذهن بینهایت طلب انسان باز کرد و او را برای رسیدن به خواسته های جاه طلبانه اش یاری رساند، در این مطلب ما اولین برخورد با CRISPR، تاریخچه کشفش در ارکی ها و باکتری ها، عملکرد و خاستگاهش را بررسی میکنیم و در انتها نگاهی کوتاه به کاربرد های آن می اندازیم.

توالی تکراری مرموز

در سال 1986 آقای Y.Ishino دانشجوی فوق دکترای دانشگاه کیوتوی ژاپن برای پروژه فوق دکترای خود در حال کار بر روی ایزوآنزیم الکالین فسفاتاز(iAP) بود این بررسی بر روی جاندار مدل پروکاریوت که E.coli k13 بود انجام میگرفت،( الکالین فسفاتاز دسته ای از انزیم های فسفاتاز اند که در pH بازی فعالیت بهینه دارند،) پس از استخراج آن بخش از DNA که حاوی توالی ایزوانزیم الکالین فسفاتاز بود، به منظره ای مرموز برخورد، او در ناحیه پایین دست ژن iAP متوجه توالی نوکلئوتیدی تکراری شده بود که با فاصله ای، دوباره همان توالی تکرار میشدند، او متوجه شد این توالی تکراری 5 بار با فاصله تکرار شده است با توجه به تکنولوژی آن زمان، بخشی از ژنوم را در اختیار داشت و برای بررسی بیشتر مجبور بود چند ماه صبر کند تا کلون های بیشتری از ژن الگو و توالی بیشتری به دستش برسد(امروزه در 1 روز این کار انجام میشود)، در سال 1987 توالی به دست  اقای Ishino  رسید و بررسی بیشتر را بر روی این توالی تکراری مرموز اغاز کرد او متوجه شد این توالی 5 بار با یک  فاصله تقریبا 32 نوکلئتیدی دوباره تکرار میشوند.

اولین توالی پیدا شده CRISPR در پایین دست ژن iAP در سال1987

این توالی 5 بار با فاصله تقریبا ثابت تکرار شده است، بعد ها در بررسی هایی که انجام شد متوجه شدند این توالی  14 بار تکرار شده و ژن cas نیز در پایین دست آن دیده شد.

این توالی تکراری عجیب در گذشته نیز دیده شده بود و به آن توالی تکراری خارج ژنی پالندرومیک یا repetitive extragenic palindromic   (REP) میگفتند که در E.coli وSalmonella enterica serovar Typhimurium  یافت شده بود و آن را به پایداری mRNA نسبت داده بودند ولی این توالی جدید هیج شباهتی به توالی REP نداشت و در هیچ یک از پایگاه های داده ثبت نشده بود. و بعد ها توالی های جدید بیشتری در سایر سویه های E.coli و برخی سویه های شیگلا و مایکوباکتریوم tuberculosis  یافت شد. اقای Ishino نتوانست ماهیت و عملکرد این توالی را متوجه شود و این توالی مرموز همچنان به صورت سوالی در ذهن پژوهشگران باقی ماند.

کشف CRISPR در آرکی ها (باستانیان) و گستره ی آن

Mojica و همکارانش در حال بررسی ژنوم هالوفیل ها(نمک دوست ها) بودند تا متوجه بشوند چرا این آرکی ها با محیط های با غلظت بالای نمک سازگارند، در این تحقیق آنها متوجه توالی های تکراری با فاصله شدند این کشف پیشرفت بزرگی را در درک ماهیت CRISPR سبب شد

تصویر Mojica او نخستین فردی بود که متوجه شد این توالی تکراری در جانداران مختلف عملکرد یکسانی دارد.
تصویر Mojica او نخستین فردی بود که متوجه شد این توالی تکراری در جانداران مختلف عملکرد یکسانی دارد.

اقای Northen Blotting متوجه شد که از این توالی رونویسی میشود، (بعد ها مشخص شد تعداد زیادی RNA از این توالی رونویسی میشوند.) او این فرضیه را مطرح کرد که ممکن است این توالی تنظیم بیان ژن و تبدیل DNA از فرم B به Z را در محیط های دارای نمک زیاد تسهیل میکند. این توالی  غنی از C و G، این کار را با اتصال به یک پروتئین تنظیمی خاص  انجام میدهد، که البته این فرضیه به دلیل جامعیت نداشتن در باکتری ها فاقد اعتبار بود،   با پیشرفت علم ژنومیکس و اختراع ماشین توالی یابی خودکار، دانشمندان به توالی ژنومی کامل دست یافتند و توانستند ژنوم جانداران بیشتری را بیابند، با بررسی بیشتر ژنوم جانداران مختلف توالی تکراری پراکنده مرموز در تعداد بیشتری از باکتری ها و آرکی ها یافت شد، که هر دانشمندی نام متفاوتی را به این توالی مرموز اختصاص میداد مثل: short regularly spaced repeats (SRSRs) یا spacers interspersed direct repeats یا به اختصار (SIDRs) و large cluster of tandem repeats (LCTRs) و این فرضیه را ارائه کرده بودند که این توالی درتقسیم کروموزومی نقش دارد اما این فرضیه هم به علت زیاد بودن و در هم بودن در ژنوم، کم اعتبار شد. اصطلاح CRISPR نخستین بار توسط Jansen در سال 2002 مطرح شد که مورد قبول همگان قرار گرفت، او 4 ویژگی برای این توالی مشخص کرد:1) آن ها در ناحیه بین ژنی قرار دارند 2)شامل توالی تکراری کوتاه با تغییر اندک اند 3) این تکرار ها با توالی های غیر محافظت شده ای از یکدیگر جداشده اند 4)یک دنباله رهبر با چند 100 باز در یک طرف این توالی تکراری قرار دارد. با بررسی بیشتر جانداران متوجه شدند که تمام ارکی ها و نیمی از باکتری ها توالی CRISPR را دارند که این موضوع باعث پررنگ شدن نقش این توالی در این جانداران شد، همچنین تا امروز یک مورد از این توالی در یوکاریوت ها گزارش نشده است و دانشمندان نتیجه گرفتند که این توالی ابتدا در آرکی ها به وجود امده و سپس به باکتری ها رسیده است

تا به حال هیچ توالی CRIsprئی در یوکاریوت ها یافت نشده است و تمام ارکی ها و بیش از نیمی از پروکاریوت ها توالی CRISPRرا دارند که این فرض مطرح میشود نخستین بار CRISPR در آرکی ها پدید آمده و سپس به پروکاریوت ها منتقل شده است. (MOJICA)
تصویر امروزی از همان ناحیه ای که Yshino نخستین بار در سال 1987 مشاهده کرد، نواحی قرمز نواحی تکراری CRISPR اند

کشف CAS

در آغاز قرن 21 ام شناسایی توالی جانداران مختلف به مقایسه توالی CRISPR در جانداران مختلف با یکدیگر کمک کرد، این مقایسه ها سبب شناسایی 4 ژن حفاظت شده در نزدیکیCRISPR شد که آن ها را Cas 1تا 4 نام گذاری کردند. واژه CAS مخفف (CRISPR-associated) به معنای مرتبط با کریسپر است. هیچ کدام از دومین های پروتئین cas 1و cas2 شباهت عملکردی با پروتئین های شناخته شده تا آن زمان نداشتند به همین دلیل عملکرد آن ها ناشناخته ماند، cas3 شامل 7 موتیف بود که جزو دسته ابر خانواده هلیکازها  بودند و cas4 مربوط به اگزونوکلئاز های RecB بود و به عنوان کمپلکس RecBCD برای برداشتن شکستگی های دورشته ای برای شروع نوترکیبی همولوگ کار میکردند طبق همین نتایج گفتند که cas3 و cas4 در متابولیسم DNA مثل ترمیم و نوترکیبی، رونویسی و جداسازی کروموزوم نقش دارند به دلیل ارتباط cas با CRISPR گفته شد پروتئین cas  در پیداش جایگاه CRISPR نقش دارد.

کشف عملکرد CRISPR

در ابتدا توالی CRISPR زیادی در ارکی های ترموفیل یافت شده بود و توالی CRISPR  بزرگتری نسبت به مزوفیل ها داشتند و گمان کردند که CRISPR در سازش میکروارگانیسم در برابر گرما نقش دارد ولی با پیدا شدن توالی بیشتر متوجه شدند این همبستگی بین CRISPR و مقاومت در برابر گرما قوی نیست و این فرضیه نیز رد شد همچنین مزوفیل های زیادی نیز پیدا شد که سیستم CRISPR را داشتند. زمان گذشت تا اینکه 2 دانشمند به طور مستقل از یکدیگر با نام های فرانسیسکو موژیکا (Francisco Mojica)و کریستین پیورسل(Christine Pourcel)در سال 2003 متوجه شدند توالی فاصله ای (spacer) در CRISPR همولوگ و مشابه ژنوم باکتریو فاژ ها، فاژها و پلازمید ها است. و باکتری هایی که این توالی همولوگ را دارند توسط آن فاژ آلوده نمیشوند. پس این فرض به وجود آمد که سیستم CRISPR ممکن است یک دفاع بیولوژیک در برابر فاژ ها باشد مثل سیستم RNAi در یوکاریوت ها که در با عوامل ژنتیکی متخاصم برخورد میکند، همچنین آنها گفتند که این سیستم میتواند قطعاتی از ژن فاژ مهاجم را در خود ذخیره کرده تا بعد ها در نسل های بعد حافظه ای برای مقابله با آن فاژ داشته باشد.

بلوتون (bloton) و همکارانش این نتایج را تایید کردند و متوجه شدند که ارتباطی بین این فاصله ها(spacer) با مقاومت باکتری در برابر فاژ وجود دارد به طوری که هر چه فاصله ها بیشتر باشد مقاومت باکتری به فاژ های مختلف افزایش میابد. که البته این یافته ها در آن زمان توسط ناشران نادیده گرفته شد که برخی علت آن را غلبه زیست شناسان مولکولی به میکروبیولوژیست ها وتکامل گرایان میدانند و تنها در سایت های تخصصی این مقاله ها منتشر شد.

در سال 2005 دو مقاله ثابت کردند که اطلاعات گذشته در مورد ژنهای cas  درست بوده اند و آنها در این سیستم ایمنی سلولی جدید نقش دارند یک سال بعد در سال 2006  ماکارو( Makarov) و همکارانش  این نقش را مورد تایید قرار دادند و به طور کامل آن را شرح دادند ماکارو  با تکیه بر کارهای قبلی خودش تجزیه و تحلیل دقیق توالی cas را انجام داد و سعی کرد عملکردش را در مکانیزمی شبیه سیستم های یوکاریوتی RNAi پیشبینی کند، که البته شباهت بسیار کمی داشت و اشاره کرد که سیستم CRISPR/cas با حافظه ای که دارد بیشتر شبیه سیستم ایمنی تطبیقی در مهره داران است با این تفاوت اساسی  که در مهره داران این سیستم ارثی نیست، همچنین پیشنهاد کرد  میتوان از CRISPR برای خاموش کردن ژن ها در میکروارگانیسم هایی که پروتئین cas را دارند بهره گرفت عملکرد سیستم CRISPR/cas در سال 2007 به طور تجربی مشخص کرد که جزء سیستم ایمنی اکتسابی است  آن هم در باکتری استرپتوکوکوس ترموفیلوس (S.thermophilus) و ثابت کردند که قرار دادن توالی فاژ در ناحیه فاصله ای(spacer) باعث مقاومت باکتری به این فاژ میشود، همچنین حذف این توالی در فاژ و تغییر آن  سبب شد که باکتری مقاومتش را نسبت به این فاژ از دست بدهد که خود تاییدی دیگر  بر عملکرد سیستم CRISPR/cas بود. همچنین مشخص شد سیستم CRISPR/cas مانع تغییر در پلازمید هایی میشود که توالی منطبق با فاصله ها(spacer) در ژن CRISPR دارند سپس گروه ون van der Oost ، سیستم CRISPR یافت شده در سال 1987 توسط یوشینو را بازسازی کردند و متوجه شدند که مولکول RNA  حاصل از بیان ژن CRISPR با پروتئین cas  همکاری میکند. در همان سال  اندرسون و بنفیلد Andersson and Banfield)) متوجه شدند که بعد از گذشت ماه ها توالی CRISPR تغییر میکند و توالی فاصله ای (spacer) جدید  از فاژ ها در آنجا ظاهر میشود. همچنین این پژوهش نشان داد که پروتئین cas9 در این مورد به تنهایی برای انکود شدن CRISPR کافی است  و متوجه شدند که سیستمCas9/CRISPR RNA قادر به جداسازی DNA هدف در شرایط آزمایشگاهی است مثلا CRISPR/Cas استرپتوکوکوس پیوجنز (pyojenes) میتواند ژنوم عصب انسان و کلیه موش را تغییر دهد(ببرد) همانطور که پیش تر توضیح داده شد ژن cas انواع مختلفی دارد و پروتئین های مختلفی را ایجاد میکنند که برخی از آن ها فعالیت نوکلئازی یا هلیکازی، پلیمرازی و…. دارند که در بخش های مختلف عملکرد CRISPR نقش دارند، cas9 نیز معروف ترین پروتئین cas است که فعالیت نوکلئازی دارد. cas های 1 و 2 که عملکرد ناشناخته ای داشتند، مشخص شد در جایگذاری spacer های جدید نقش دارند.

شرح عملکرد CRISPR/Cas

تا اینجا متوجه شدیم که CRISPR شامل نواحی کوچک نوکلئوتیدی تکراری است که توسط توالی نوکلئیدی متفاوت که به آن ها فاصله دهنده میگوییم تشکیل شده است، همچنین پالیندروم است (دو سرخوان ) و فهمیدیم که این فاصله ها، با بخشی از DNA فاژ همولوگ ( یکی) است. حال به نحوه عمل این سیستم ایمنی میپردازیم، در ابتدا به اولین برخورد باکتری با یک فاژ میپردازیم که به  آن مرحله Adaption یا همان سازگاری میگویند.

مرحله سازگاری

فاژ بر روی باکتری قرار میگیرد و ژنوم خود را به درون باکتری تزریق میکند، ژنوم فاژ اگر از بین نرود باعث مرگ باکتری میشود. از این رو از ژن cas 2پروتئین به اسم cas1 و cas2 ساخته میشود و به سمت ژن مهاجم حرکت کرده و آن را تکه تکه میکنند، سپس بخشی از آن تکه ژن را در ژن CRISPR جا سازی میکنند و یک spacer یا فاصله دهنده جدید تشکیل میشود.

مرحله پردازش(آماده سازی)

حال فرض کنید بعد ها دوباره همان فاژ به باکتری حمله کند، در این حالت به دلیل اینکه از قبل بخشی از DNA مهاجم در CRISPR وجود دارد، از توالی CRISPR رونویسی میشود و یک RNA تولید میشود که به آن pre-crRNA میگویند، از آنجایی که این RNA مربوط به ژن CRISPR است به آن crRNA میگویند، همچنین به دلیل وجود توالی تکراری در آن و یکپارچه بودن RNA به آن “پیش” یا به تعبیر دیگر crRNA نابالغ میگویند. پروتئین cas خاص به نام cas9 که فعالیت نوکلئازی دارد(در استرپتو کوکوس پیوژنز(pyogenes) کشف شد) میتواند DNA را برش دهد، این پروتئین با کمک یک رشته کوچک از RNA که به آن tracerRNA میگویند به بخشی از توالی تکراری متصل شده و سبب راهنمایی cas9 به جایگاه spacer میشود و باعث نگه داری crRNA در پروتئین cas9 میشود. همچنین وجود این tracerRNA برای پیرایش یا همان حذف توالی تکراری لازم است، این توالی تکراری پالیندروم که در بخش هایی بین باز های آن پیوند هیدروژنی برقرار شده و ساختار سنجاق سر گرفته آنزیمی به نام Ribonuclease 3 یا به اختصار RNase III آن ها را برش میدهد و حذف میکند و pre-crRNA به crRNA هایی تبدیل میشود که  هر یک به یک tracerRNA و cas9  متصل اند

مرحله 3

حال در این مرحله یک کمپلکس با 3 جزء داریم: پروتئین cas9، tracer RNA و crRNA که  یک spacer یا همان یک نوع خاص از توالی یک فاژ  خاص است. که به کل این کمپلکس effector complex میگویند، همچنین ترکیب tracerRNA-crRNA را guideRNA (RNA راهنما) یا به طور خلاصه sgRNA می نامند. حال باکتری آماده مقابله با ژن مهاجم است. کمپلکسی که crRNA آن با ژن مهاجم یکسان باشد به ژن مهاجم از طریق crRNA با پیوند هیدروژنی بین جفت باز های مکمل متصل شده و پروتئین cas9 با شناسایی توالی خاص به نام protospacer Adjacent Motif یا PAM چند باز بالاتر از توالی PAM شروع به بریدن دو رشته DNA میکند و این چنین ژن مهاجم غیر فعال و نابود میشود.

دسته بندی سیستم CRISPR

سیستم CRISPR با توجه به نوع پروتئین کمپلکس موثر(Effector complex) به 2 کلاس کلی تبدیل میشوند. کلاس1) کمپلکس موثر آن از چند پروتئین Cas چند زیرواحدی تشکیل شده است و کلاس2) از یک پروتئین چند زیرواحدی تشکیل شده است. موردی از عملکرد کلاس 2 را در بالا تشریح کردیم که معروف ترین پروتئین آن cas9 یک پروتئین چند زیرواحدی است که فعالیت نوکلئازی و هلیکازی را خود به تنهایی انجام میدهد. کلاس 1 در اکثر باکتری ها و ارکی ها یافت میشود به خصوص گرما دوست ها و 90 درصد CRISPR های شناخته شده جز دسته کلاس 1 اند، 10 درصد باقی مانده مربوط به کلاس2 است که تنها در باکتری ها دیده شده است. هر کدام از این کلاس ها به 3 نوع  دسته بندی میشوند، نوع 1،3،4  در کلاس 1 و نوع 2،5،6 در کلاس 2 مثلا CRISPR/cas9 در کلاس 2 و نوع 2 قرار دارد. همچنین هر کلاس هم به شاخه های مختلف A,B,C,D,F,U تقسیم میشوند، مثلا تایپ3

دسته بندی سیستم های CRISPR، نوع پروتئین های دخیل در 3 مرحله سیستم CRISPR/cas نمایش داده شده است نوع 1، 2 و 3 به دلیل وجود پروتئین های منحصر به فرد به راحتی قابل تشخیص اند، نوع 4 به دلیل عدم وجود پروتئین های cas 1و2 در مرحله سازش، نحوه عمل آن ناشناخته است.

سیستم های کلاس 2 برای ویرایش ژنوم مناسب تر اند

سیستم های CRISPR/cas کلاس 2 به دلیل تک بودن پروتئین موثر آن پیچیدگی کمتری نسبت به کلاس 1داشته و روند استفاده از آن ساده تر است، در این میان پروتئین cas9 رایج ترین پروتئین این کلاس است، cas9 نخستین بار در استرپتوکوکوس پیوژنز دیده شد، این پروتئین یک اندو نوکلئاز وابسته به  یک crRNA است که متشکل از دو زیرواحد است، زیرواحد بالایی REC(recognition) که وظیفه شناسایی و تشخیص نوکلئیک اسید ها را بر عهده دارد و زیرواحد پایینی به نام NUC(nuclease) که فعالیت نوکلئازی دارد، این زیرواحد شامل 2 دومین نوکلئازی به نام HNH,RUVc است که هر کدام به طور مستقل یکی از رشته های DNA خارجی را برش میدهد، همچنین در ناحیه c ترمینال آن یک دومین برهمکنشی با جایگاه pam به نام PAM-Interaction(PI) دارد که با جایگاه pam برهمکنش میدهد. Cas9 فعالیت هلیکازی نیز دارد و 2 رشته DNA را باز میکند تا crRNA بتواند با بخش مکمل خود پیوند هیدروژنی برقرار کند مکانیزم عمل پروتئین cas9 در شکل 7 نمایش داده شده که توسط تجزیه تحلیل های بلوری کمپلکس DNA-crRNA-cas9 مشخص شده است

CRISPR/Cas9 راهی برای ویرایش ژنوم

در سال 2012 Jennifer Doudna و Emmanuelle Charpentier که به ترتیب دکترای  میکروبیولوژی و سلولی مولکولی داشتند، پیشنهاد دادند که میتوان از CRISPR/cas9  برای ویرایش ژنوم استفاده کرد، آنها ابزار ویرایش ژنوم در انسان و حیوانات و گیاهان را مطرح کردند که در نهایت در سال 2020 برایشان نوبل شیمی به ارمغان اورد، آنها tracer RNA,crRNA را  با یکدیگر ترکیب کردند و یک مولکول RNA واحد را تشکیل دادند و نامش را chimera که نام یک موجود باستانی است که از ترکیب چندین موجود مختلف به وجود آمده است گذاشتند،chimera یا نام دیگر آن guide RNA(sg-RNA)  single-یا همان RNA راهنما، میتواند با cas9 ترکیب شده و کمپلکس موثر را تشکیل دهد، در این روش sgRNA مناسب که مکمل ژن هدف است در آزمایشگاه ساخته میشود پروتئین cas9 نیز از باکتری استریپتوکوکوس پیوژنز استخراج میشود و سپس sgRNA و cas9 را به سلول میزبان تزریق میکنیم، در آنجا 3 مرحله اتفاق می افتد،1)تشکیل کمپلکس sgRNA+cas9 2)کمپلکس شروع به خوانش توالی DNA میکند تا ژن مکمل sgRNA و توالی PAM را پیدا کند، 3)sgRNA با ژن هدف پیوند هیدروژنی برقرار میکند4)cas9 با فعالیت نوکلئازی خود DNA را در نقطه مورد نظر برش میدهد.  با این روش میتوان هر قسمتی از DNA را که میخواهیم با ساخت sgRNA مناسب برش داد(نهایت 20 جفت باز را میتوان برش داد) پس از بریده شدن DNA مکانیزم های تعمیری DNA فعال میشوند و شروع به بازسازی DNA میکنند.  این مکانیزم ها به 2 صورت اتفاق می افتد، HDR(Homology-directed Repair) و NHEJ(non-Homologous end joining)، در روش HDR، DNA با الگویابی از DNA همولوگ(donor template) دوباره باز سازی میشود و درصد خطا و جهش در این روش کمتر است، در روش NHEJ سلول سعی میکند به صورت تصادفی DNA را تعمیر کند که درصد خطا در این روش بیشتر است، دانشمندان سعی میکنند همراه با فرستادن sgRNA/cas9 یک ژن را نیز به سلول تزریق کنند تا در صورت برش DNA توسط Cas ژن ساخته شده جایگزین آن شود، البته کارایی این روش پایین و ریسک و خطای آن زیاد است معمولا از روش NHEJ برای حذف ژن معیوب استفاده میکنند، و روش HDR برای تعمیر ژن معیوب زیرا پس از برش ژن معیوب سلول DNA را با استفاده از DNA همولوگ خود تعمیر میکند و اگر DNA همولوگ الل سالم را داشته باشد، الل سالم جایگزین الل معیوب شده است.

کاربرد های استفاده از CRISPR/Cas9:

مقابله با باکتری های مقاوم به انتی بیوتیک، با جدا کردن بخش پاتوژنیک باکتری انجام شد به طور مثال از بین بردن باکتری های مقاوم به آنتی بیوتیک استافیلوکوکوس که پوست موش را آلوده میکرد.

گزارش شده است که CRISPR/cas از عفونت روده ای توسط E.coli هم جلوگیری کرده است البته چالش هایی مثل روش انتقال برای ایمنی وجود دارد.

سیستم CRISPR/cas  کاربرد های گسترده ای در صنایع مختلف دارد، تولید باکتری های مقاوم به فاژ در صنعت غذا برای حفظ بیشتر باکتری های مفید غذا،شناسایی یک موقعیت خاص در DNA و یا اثر یک ژن بر عملکرد سلول.با غیر فعال کردن جایگاه های نوکلئازیCas9،cas9 غیر فعال (dcas9) به وجود می آید dcas9 میتواند ژن را تشخیص دهد و به آن متصل شود ولی توانایی برش آن را ندارد، که با این عمل میتوان ژن را غیرفعال کرد زیرا به دلیل ازدحام فضایی مانع از رونویسی از ژن میشود که برای مطالعه عملکرد یک ژن مناسب است همچنین با رنگ امیزی cas9 با رنگ فلورسنس سبز(GFP)، میتوان محل ژن مورد نظر در یک سلول را پیدا کرد، همچنین اتصال dcas9 به پروموتور یک ژن و جایگاه های تنظیمی آن میتواند بیان یک ژن را به طور موقت تنظیم کند.


در انسان نیز با هدف ژن درمانی میتوان از تکنیک CRISPR/cas استفاده کرد برای حذف ژن معیوب به روش NHEJ و یا جایگزینی الل معیوب با الل سالم با روش HDR، بررسی ها نشان داده که CRISPR/CAS میتواند در کاهش میزان بیان ویروس HIV در سلول های T انسان مورد استفاده قرار گیرد، مبارزه با سرطان به روش IMMUNOTHERAPY که در آن از سیستم ایمنی بدن برای مبارزه با سرطان استفاده میشود با استفاده از CRISPR/CAS امکان پذیر که در مقاله ای دیگر به موضوع کاربرد های آن در ژن درمانی و ویرایش ژنوم صحبت میکنیم.

خاستگاه CRISPR

در طی بررسی نواحی ای در ژنوم ارکی ها که به آن جزایر ماده تاریک میگویند، چند جزیره حاوی ژن انکود کننده ی پروتئین cas1 دیده شد که با نواحی CRISPR مرتبط نبودند و آن را  cas1-solo نامیدند. بررسی های بیشتر این جزایر نشان داد که ژن cas1-solo همواره در مجاورت ژن های انکود کننده B-DNA  پلیمراز و چند ژن محافظت شده دیگر است، همچنین ساختاری شبیه transposon ها دارد، transposon ها قطعات ژنی متحرک اند که قابلیت جا به جایی در ژنوم سلول را دارند و به 2 کلاس تقسیم بندی میشوند کلاس 1: این جا به جایی توسط رونویسی از ژن transposon است که سپس از RNA حاصل نیز رونویسی معکوس میشود و به یکدیگر متصل و یک زنجیره 2 رشته ای نوکلئیک اسید را تشکیل میدهند و سپس به ژنوم متصل میشود. کلاس 2: در این روش انزیم هایی از ژن transposon ساخته میشود که وظیفه انها جدا کردن transposon و انتقال آن به جایگاه دیگر ژنوم است. Transposon از 2 منطقه تشکیل شده است، منطقه اول که در میانه قرار دارد transposos نام دارد که انزیم transposase را کد میکند، و منطقه 2 که در دو طرف transposos قرار دارد TIR(target inverted repead) ناحیه هدف تکرار معکوس نام دارد و ناحیه سوم تکرار مستقیم direct reaped نام دارد که در نتیجه عمل transposon یا همان جا به جایی ژنی به وجود می آید.


کلاس2 transposon شامل 3 مرحله است، 1)Excision 2)Drift 3) Integration پروتئین های انکود شده از ژن transposase نواحی TIR را شناسایی کرده و در آن ناحیه برش ایجاد و ژن را جدا میکنند. در مرحله 2  transposase ها transposon را به سمت ناحیه target site جدید منتقل میکنند  و در مرحله آخر، DNA را برش داده و ژن را در ناحیه برش اضافه میکنند، این اضافه شدن سبب میشود در 2 طرف transposon، ناحیه direct repeat به وجود اید.

اجزای transposon را نشان میدهد، ناحیه قرمز ژن انکود کننده transpose ها است، ناحیه آّبی TIR  و ناحیه سبز که نتیجه عمل transposon است DR یا target site duplication است که با دیدن این ناحیه در ژن میتوان فهمید که قبلا در این محل transposon اتفاق افتاده است.

شبیه این نواحی TIRو ِDR در اطراف ژن cas1-solo نیز دیده شده است که این فرضیه را ایجاد میکند که قابلیت transposon ی دارد ولی بررسی های بیشتر نشان داد که هیچکدام از ژن های transposon انکود کننده cas1 نیستند و یا ساختاری شبیه cas1-solo ندارند در نتیجه فرض بر این شد که پروتئین cas1-solo عامل جابه جایی این توالی جدید transposon است و این توالی جدید را casposone نامیدند(اشاره به پروتیئنcas1 برای جا به جایی)

Casposon ها به طور وسیع در methanogenic ارکی ها و thaumarchea یافت شده است همچنین در گروهی از باکتری های متفاوت نیز دیده شده است.

تحرک casposon ها با تجزیه تحلیل ژنومی بیش از 60 سویه archaeon Methanosarcina mazei  اثبات شد، در این بررسی متوجه پراکندگی casposon در ژنوم شدند که علت آن جا به جایی این قطعات ژنی  بود

 Casposonها بر اساس تاکسونومی و فیلوژنی به 4 کلاس مختلف تقسیم بندی میشوند

خصوصیات بیوشیمی پروتئین  cas1-solo casposon  که به آن caspase نیز میگویند،  پیشبینی فعالیت اینتگرازی integrase را تایید کرد واین عمل شبیه به مرحله adaptation تطبیق در CRISPR/cas است، بررسی ژنومی aciduliprofundum boonei و thermophilc archaeon نواحی TSD در عمل integration دیده شد. قطعات TSD شبیه به نواحی leader sequence-proximal کریسپر هنگام اتصال protospacer است که در مرحله adaptation تطبیق(سازگاری) توسط cas1وcas2  کاتالیز میشدند. این دو عمل از لحاظ عملکردی شباهت دارند، 1)تولید TSD پس از اتصال ژن توسط caspase ها در casposon و تولید واحد کریسپر در هنگام اتصال protospacer توسط cas1,cas2 2) هر دو توالی خاصی برای هدایت و تعیین دقیق محل اتصال ژن در بالا دست ژن دارند(TSD-proximalدر ژنوم booni و توالی رهبر در crispr)

در مجموع بررسی و مقایسه ژنوم ها و نتایج تجربی، شباهت های مکانیکی بین casposon ها و سیستم تطبیقی پروکاریوت ها را تقویت کرد، و این سناریو را مطرح کرد که غیر فعال کردن تحرک casposon ها با تغییر در TIR که در نزدیکی یکsolo effector” “، سبب افزایش  adaptation و effector mulcole میشود و تکرار های  crisprو توالی رهبر ان مستقیما  از TSD منشا گرفته اند، البته در این سناریو یک سوال مهم وجود دارد آن هم تغییر سوبسترا casposon از یک توالی بزرگ و ثابت به توالی کوچک به نسبت casposon و متفاوت است که جواب آن احتمالا به همکاری و جفت شدن  cas1 و cas2 مربوط باشد.

البته که تنها منبع تکاملی crispr/cas ها casposon ها نیستند، شواهد زیادی وجود دارد که پروتئین هایII,V class2 crispr از transposon های کوچک  منشا شده اند که حوزه های مشابه نوکلئازی RuvC را اهدا کرده اند.

: مراحل transposon: مرحله اول  excision که در آن transpose به TIR متصل شده و برش را ایجاد میکند مرحله دوم Driftکه ژن را به سمت TS جدید هدایت میکند و مرحله سومintegration یا الحاق است

منابع:

History of CRISPR-Cas from Encounter with a Mysterious Repeated Sequence to Genome Editing Technology

https://youtu.be/MnYppmstxIs

https://youtu.be/IiPL5HgPehs

تکنولوژی CRISPR/Cas9و کاربرد آن در درمان بیماریهای ژنتیکی

تصــــــــــــــویر زمینه

نویسنــــــــــــــــــــــده

آرمان بزرگی

فـــــهرست مطالب

دیدگاهتان را بنویسید

نشانی ایمیل شما منتشر نخواهد شد. بخش‌های موردنیاز علامت‌گذاری شده‌اند *

BIOVERSE